Instruções para o exame: Prova Cruzada de Linfocitos T e B (Doador)

Exigência	Descrição
Materiais	Sangue Periférico
Conservantes	ACD
Volume Recomendável	3 tubos ACD de 8,5mL.
Tempo de Jejum	Jejum não obrigatório
Conservação	Colher 3 tubos ACD (tampa amarela) de 8,5ml de sangue periférico - estável em temperatura ambiente por 72 horas
Critérios de Rejeição	Amostras de sangue periférico congeladas. Presença de coágulo ou hemólise grosseira. Amostras coletadas em conservante inadequado.
Critérios de Restrição	Amostra com volume inferior ao solicitado. Avarias no tubo e/ou recipiente do material enviado. Amostra fora do prazo de viabilidade Amostras sem a correta identificação. Amostras coletadas há mais de 72 horas que não estiverem estocadas adequadamente. Paciente que tiver recebido transfusão sanguínea no prazo inferior a 15 dias ou tiver recebido imunoglobulina no prazo inferior a 24 horas. Falta de requisição médica.
Observações	Em caso de indisponibilidade de coleta no tubo ACD, pode ser utilizado alternativamente o tubo de heparina. A coleta deste exame é realizada de segunda a quarta-feira de 8h a 10h, devido a viabilidade celular. Para a realização deste exame é necessário o preenchimento do questionário em anexo. Amostra do receptor e doador devem ser coletadas juntos.
Última Atualização	24/08/2023
Documentos Obrigatórios	Formulário de Requisição Requisição Médica Termo de Consentimento

Metodologia

A metodologia usada no exame é Linfotoxicidade dependente de complemento e/ou Citometria de fluxo.

A Prova Cruzada é uma técnica utilizada para determinar a existência de anticorpos anti HLA no soro do receptor direcionados contra os antígenos HLA expressos na membrana da célula do doador e pode ser realizada pela metodologia de Linfotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou pelo método de Citometria de fluxo. Linfotoxicidade dependente de complemento (CDC): Em placas de Terasaki, o soro do receptor é incubado com linfócitos T e B do doador. Se existirem anticorpos pré-formados no soro, o anticorpo se unirá aos antígenos HLA expressos na superfície dos linfócitos do doador, formando o complexo antígeno-anticorpo. Após esta incubação, adiciona-se soro de coelho como fonte de complemento. O componente C1q do sistema complemento irá se ligar à porção Fc do anticorpo, e esta ligação inicia a cascata do complemento que resultará na lise da célula, o que será observado ao microscópio de imunofluorescência após a adição de corante. Nas reações positivas os linfócitos ficarão corados em vermelho e nas negativas ficarão corados em verde. Citometria de fluxo: Os linfócitos T e B do doador são separados por seleção negativa utilizando a técnica RosseteSep e separação por gradiente de densidade Ficoll-Hypaque e cruzados com o soro do receptor. É adicionado o reagente anti-IgG que irá se ligar onde houver ligação antígeno-anticorpo e emitir fluorescência, também é adicionado anti-CD3 (linfócitos T) e anti-CD19 (linfócitos B) que se ligam nos linfócitos possibilitando a diferenciação dos linfócitos T e B. Esta reação é analisa pelo Citômetro de Fluxo que gera dados brutos que são interpretados pelo setor de Histocompatibilidade. A reação positiva indica a presença de anticorpo anti-HLA doador específico e recomenda-se a busca de um novo doador.

Limitações do exame

A Prova Cruzada por Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) tem menor sensibilidade se comparada com a Prova Cruzada por Citometria de Fluxo.