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Instruções para o exame: Sequenciamento para HLA classe I e II

Exigência	Descrição
Materiais	Sangue Periférico DNA Saliva Swab Bucal (quando necessário)
Conservantes	EDTA Microtubo de 1,5 mL Kit Saliva OCR-100 (ORAcollect) ou OG-500 (Oragene) Swab estéril para coleta de amostras de DNA em tubo sem conservantes
Última Atualização	01/09/2022
Volume Recomendável	Sangue/Medula óssea: mínimo 2 mL, ideal 4 mL Saliva: mínimo de 1,5 mL Swab: enviar em tubo sem conservantes
Tempo de Jejum	Jejum não obrigatório
Orientação	Pacientes candidatos ao 2 transplante deverão realizar o teste na amostra de Swab Bucal. (Swab)- É recomendado não beber café, não comer, fumar, mascar chicletes ou escovar os dentes 30 minutos antes da coleta. Qualquer tipo de protetor bucal (batom ou manteiga de cacau) deve ser removido. A coleta do material deve ser realizada obrigatoriamente com luvas durante todo processo de modo que não haja nenhum contato com o material. Realizar o esfregaço do swab por 90 segundos em cada lado da mucosa bucal e colocar imediatamente em um frasco seco, esteríl e vedar. Ter cuidado ao realizar o esfregaço para não causar ferimentos e contaminar o swab com sangue.
Conservação	(Sangue)- Colher 4 ml de sangue em um tubo com EDTA (tampa roxa) - estável em temperatura ambiente por 7 dias, refrigerada por 30 dias e congelada (-20°C à -80°C) por tempo indeterminado. Saliva em tubo OCR-100 (ORAcollect) ou OG-500 (Oragene): enviar a amostra num prazo máximo de 15 dias (temperatura ambiente, 18-25ºC ou refrigerada, 2-8ºC), por courier. (Swab)- O material é estável por 48 horas em temperatura ambiente.
Critérios de rejeição	Amostras congeladas Amostras sem identificação Amostras com volume insuficiente Amostras coletadas em conservante inadequado
Critérios de restrição	Amostras coletadas em heparina. Amostra com volume inferior ao solicitado. Avarias no tubo e/ou recipiente do material enviado. Amostra fora do prazo de viabilidade. Amostra sem a correta identificação. Ausência de documentação. Amostra com grau leve de coagulação.
Documentos Obrigatórios	Formulário de Requisição Requisição Médica Termo de Consentimento

Metodologia

A metodologia usada no exame é Sequenciamento HLA.

O DNA é extraído de sangue periférico ou saliva de forma automatizada (QIASymphony) e então é submetido a uma PCR long-range para amplificação de todo o gene HLA. Após a amplificação o DNA é submetido à fragmentação e tagmentação utilizando Nextera. O material fragmentado é então indexado e sequenciado utilizando sequenciador de segunda geração (NGS). Os dados são analisados e comparados com bancos de dados utilizando um software gerando uma tipagem HLA de alta resolução.