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Instruções para o exame: Tipificação HLA locus B em média resolução

Exigência	Descrição
Materiais	Sangue Periférico DNA Saliva Swab Bucal (quando necessário)
Conservantes	EDTA Microtubo de 1,5 mL Kit Saliva OCR-100 (ORAcollect) ou OG-500 (Oragene) Swab estéril para coleta de amostras de DNA em tubo sem conservantes
Última Atualização	29/05/2024
Volume Recomendável	Sangue/Medula óssea: mínimo 2 mL, ideal 4 mL Saliva: mínimo de 1,5 mL Swab: enviar em tubo sem conservantes
Tempo de Jejum	Jejum não obrigatório
Orientação	Pacientes candidatos ao 2 transplante deverão realizar o teste na amostra de Swab Bucal. (Swab)- É recomendado não beber café, não comer, fumar, mascar chicletes ou escovar os dentes 30 minutos antes da coleta. Qualquer tipo de protetor bucal (batom ou manteiga de cacau) deve ser removido. A coleta do material deve ser realizada obrigatoriamente com luvas durante todo processo de modo que não haja nenhum contato com o material. Realizar o esfregaço do swab por 90 segundos em cada lado da mucosa bucal e colocar imediatamente em um frasco seco, esteríl e vedar. Ter cuidado ao realizar o esfregaço para não causar ferimentos e contaminar o swab com sangue.
Conservação	(Sangue)- Colher 4 ml de sangue em um tubo com EDTA (tampa roxa) - estável em temperatura ambiente por 7 dias, refrigerada por 30 dias e congelada (-20°C à -80°C) por tempo indeterminado. Saliva em tubo OCR-100 (ORAcollect) ou OG-500 (Oragene): enviar a amostra num prazo máximo de 15 dias (temperatura ambiente, 18-25ºC ou refrigerada, 2-8ºC), por courier. (Swab)- O material é estável por 48 horas em temperatura ambiente.
Critérios de rejeição	Amostras congeladas Amostras sem identificação Amostras com volume insuficiente Amostras coletadas em conservante inadequado
Critérios de restrição	Amostras coletadas em heparina. Amostra com volume inferior ao solicitado. Avarias no tubo e/ou recipiente do material enviado. Amostra fora do prazo de viabilidade. Amostra sem a correta identificação. Ausência de documentação. Amostra com grau leve de coagulação.
Documentos Obrigatórios	Formulário de Requisição Requisição Médica

Metodologia

A metodologia usada no exame é PCR-SSOP.

O DNA é extraído de sangue periférico ou saliva de forma automatizada (QIASymphony). O método de “Polymerase Chain Reaction – Reverse Sequence Specific Oligonucleotide Probe” (PCR-SSOP) é baseada na amplificação específica de éxons do gene utilizando primers biotinilados. Após a amplificação, os fragmentos são hibridados com beads marcados com sondas específicas. Após isto, um marcador fluorescente é acrescentado à reação para identificação das beads positivas e negativas. A leitura é realizada em um citômetro de fluxo que identifica a positividade de cada bead bem com sua especificidade. O resultado é analisado utilizando um software que interpreta a positividade de cada bead e compara com um banco de dados e seleciona o resultado da amostra.

Limitações do exame

A técnica de PCR-SSOp “Polymerase Chain Reaction – Reverse Sequence Specific Oligonucleotide Probe” resulta em tipificações HLA em média resolução.